OSID：
豆粕是豆油生产过程中的主要副产物,富含蛋白质和必需氨基酸,然而豆粕制品保留了由醛、酮和胺类等挥发性化合物产生的大豆特有的豆腥味,降低了风味品质[1]。生物酶解技术是天然调味基料生产的常用方法,具有反应条件温和、耗能低、污染少、反应定向可控等诸多优点,是目前提高豆粕利用率的重要手段之一[2]。豆粕在酶解过程中,催化分解蛋白质肽键,将大分子蛋白降解成小分子蛋白、小肽、氨基酸等,提高豆粕的营养价值,产生更多的挥发性风味物质,改善豆粕风味[3]。由于蛋白酶具有底物专一性,不同蛋白酶作用于肽链的位点不同,对酶解物的风味成分也有重要影响[4]。例如,文献[5]通过α-淀粉酶、普鲁兰聚糖酶、α-淀粉酶和普鲁兰酶双酶酶解分析苦荞麦中挥发性风味化合物的组成和含量,结果发现双淀粉酶水解对苦荞麦的营养成分和风味的改善最为明显。文献[6]为了制备具有较好功能特性和低苦味的蛋白质酶解物,用7种蛋白酶酶解大豆粉,结果发现风味蛋白酶酶解物不仅具有最好的乳化活性和乳化稳定性,并且降低了苦味值。然而,豆粕与不同蛋白酶酶解产生的风味成分之间的关系仍不清晰,因此,本文通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和顶空-气相色谱-离子迁移谱(Headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy,HS-GC-IMS)研究不同蛋白酶酶解对豆粕挥发性风味成分的影响。
目前,在挥发性风味成分检测中多采用HS-SPME-GC-MS技术[7]。文献[8]采用HS-SPME-GC-MS评估酿酒酵母和植物乳杆菌对豌豆蛋白豆腥味的影响,发现酿酒酵母和植物乳杆菌发酵可以去除豌豆蛋白中的豆腥味。文献[9]采用HS-SPME-GC-MS联用技术对低孢根霉发酵的甘薯渣的挥发性风味进行分析,发现发酵可以增强甘薯渣的香气。HS-SPME-GC-MS是食品中分离和定量挥发性化合物的常用方法,但此技术无法分析鉴定出一些含量少但对风味至关重要的物质[10]。HS-GC-IMS是近年来新兴的一种分析方法,该技术基于离子迁移分离原理能够高效分离化合物中的同分异构体,具有灵敏度高、分析速度快、操作简单等优点,且样品几乎不需要任何前处理[11]。由于HS-GC-IMS技术相对于传统分析技术具有诸多优势,其在挥发性有机化合物(Volatile organic compounds,VOCs)分析中具有较大的应用潜力[12]。但应用此技术检测豆粕风味成分的研究较少。因此,本文采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS两种技术结合的方法对不同豆粕酶解物(Soybean meal hydrolysates,SMH)挥发性风味成分进行研究。
本文采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对豆粕进行单酶酶解,通过HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS对不同SMH中风味物质进行检测,并结合主成分分析(Principal component analysis,PCA)、聚类热图和正交偏最小二乘判别法(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)对不同SMH中风味物质进行分析,比较挥发性香气成分的差异,旨在为豆粕的酶解及深加工利用提供理论参考。
大豆,黑龙江省九三粮油工业集团;碱性蛋白酶(200 000 U/g),中性蛋白酶(50 000 U/g),木瓜蛋白酶(100 000 U/g),风味蛋白酶(酶活力500 U/g以上),北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为分析纯。
AL204型分析天平,梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司;HP-5MS型色谱柱和气相色谱质谱联用仪,美国Agilent公司;MXT-5型色谱柱和FlavourSpec型GC-IMS联用仪,德国Gesellschaft für Analytische Sensorsystem(G.A.S)公司;20 mL顶空样品瓶,美国Supelco公司。
1.3.1 豆粕酶解物制备
参考文献[13]的酶解方法选取4种蛋白酶的最佳酶解条件,大豆经清选、干燥、脱皮后,将其输送到榨油机内,于40℃、3 MPa压榨提取油脂,经分离得到冷榨豆饼,对冷榨后形成的豆饼进行粉碎过 80目筛即得豆粕。将豆粕样品用蒸馏水配制成8%的豆粕悬浊液,于121℃灭菌15 min,冷却至室温(20℃),利用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液调节酶解体系至蛋白酶最适pH值,加入适量蛋白酶后放入摇床振荡,防止豆粕样品产生聚沉,温度保持在蛋白酶最适酶解温度,利用1 mol/L NaOH溶液调节酶解体系使pH值保持不变,酶解一定时间后,取出酶解液,沸水浴10 min灭酶。以8 000 r/min离心15 min,取上清液,即为豆粕酶解液。蛋白酶最佳酶解条件及水解度见表1。
表1 蛋白酶最佳酶解条件和水解度
Tab.1 Optimal enzymatic conditions and hydrolysis of proteases
参数数值碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶pH值10.05.85.85.8温度/℃50505053时间/h3.05.05.52.5酶底比1∶5001∶1001∶501∶20水解度/%23.7618.5115.7214.04
注:表中酶底比指所用酶质量与豆粕质量的比。
1.3.2 HS-GC-IMS测定
样品预处理条件[9]:将10 mL样品置于80℃下,孵化15 min,孵化转速为500 r/min。顶空进样针温度80℃,进样量为0.2 mL,不分流模式,清洗时间30 s。
GC检测条件:MXT-5型色谱柱(15 m×0.53 mm×1 μm);柱温60℃,载气为高纯氮气(纯度99.999%以上);色谱柱1流速150 mL/min,色谱柱2流速2 mL/min保持2 min,10 min内线性增至10 mL/min,20 min内线性增至100 mL/min。
IMS检测条件:漂移管长度为5 cm,漂移管温度45℃,漂移气为高纯氮气(纯度99.999%以上),流速为150 mL/min,探测器温度为45℃。
1.3.3 HS-SPME-GC-MS测定
根据文献[8]的方法并稍作修改。
(1)萃取:称取8 mL样品于顶空瓶中,添加20 mL内标(2-甲基-3-庚酮甲醇溶液),用PTFE-silicone瓶盖密封。置于80℃水浴中平衡20 min,再将已老化完成的DVB/CAR/PDMS型固相微萃取萃取头(美国Agilent公司)刺入顶空瓶中,在80℃水浴下萃取30 min。进样温度设为250℃,解析5 min。
(2)GC条件:选用HP-5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);初始柱温设为50℃,保持2 min,以5℃/min升至180℃,保持5 min,再以10℃/min升至250℃,保持5 min;进样口温度250℃,传输线温度280℃;载气(He)流速1.0 mL/min;不分流模式。
(3)MS条件:离子源温度为230℃;四级杆温度为150℃;电子能量为70 eV;采用电子轰击电离源(EI),扫描范围为40～600(质荷比)。
1.3.4 数据处理
酶解物中挥发性成分采用NIST 11/Wiley 7.0谱库进行定性分析;使用LAV (Laboratory Analytical Viewer)软件、Reporter插件、Gallery Plot插件处理HS-GC-IMS数据;采用Origin 2022软件绘制雷达图、PCA图、聚类热图;SIMCA 14.1软件进行PCA和OPLS-DA分析,计算预测变量重要性投影(Variable importance in projection,VIP);结合IBM SPSS Statistics 25.0进行数据处理及显著性检验。
2.1.1 HS-GC-IMS三维光谱及指纹图谱分析
为探究4种SMH的风味差异,利用HS-GC-IMS对不同样品进行了分析。图1a中X、Y、Z轴分别表示离子漂移时间、气相色谱保留时间和离子峰强度[14]。每个点即样品中的一种挥发性成分,物质浓度越高则对应的点颜色越深,红色较高,蓝色较低[15]。由图1a、1b可知,绝大多数VOCs的保留时间都在100～700 s范围内、漂移时间都在0.5～1.0 ms之间[16]。其中,碱性蛋白酶酶解物所含的挥发性化合物较多。如图1b所示,比较了豆粕与其他SMH的风味差异,A区域的VOCs在碱性蛋白酶酶解物中数量最多且含量高,B区域的VOCs在其余3种SMH中含量较高并存在细微差异,说明了不同SMH的VOCs的组成和含量都存在差异。
图1 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-GC-IMS三维荧光光谱、俯视图、差异对比图和指纹图谱
Fig.1 Three-dimensional spectrum,difference spectrum,qualitative analysis and fingerprint in HS-GC-IMS spectra of VOCs in soybean meal and different SMH
从图1d可以看出,豆粕及4种SMH中所含具体VOCs的含量信息,可以更加直观地体现不同SMH间挥发性化合物的差异。以豆粕为对照将指纹图谱分为A、B、C、D、E、F 6个区域。A、B、C、D分别为4种SMH的特征峰区。E区为碱性蛋白酶和风味蛋白酶SMH共有的VOCs,F区为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶SMH共有的VOCs。碱性蛋白酶SMH中共有19种VOCs是其特有的物质,主要是酯类。风味蛋白酶SMH中特有的VOCs有11种。木瓜蛋白酶SMH中特有的VOCs有3种,分别为反-2-辛烯醛、2-丁酮、醋酸。中性蛋白酶SMH中特有的VOCs为2-正丁基呋喃和乙酸丙酯。由图1d可知,4种SMH与豆粕相比特征风味差异明显,在HS-GC-IMS指纹图谱中4种SMH各有其特征区域,其中风味蛋白酶SMH的特征峰区域包含的VOCs显著多于其它样品,这些特征区域中所含的挥发性化合物可能是因为风味蛋白酶是内切酶和外切酶的混合物,外切酶可有效地将大豆多肽端基的疏水性氨基酸切除,降解苦味肽,产生特殊的风味物质[17]。该结果与文献[6]用风味蛋白酶酶解大豆蛋白的研究结果类似,即风味蛋白酶酶解大豆蛋白产生的特殊风味物质有掩盖苦味的作用。
2.1.2 HS-GC-IMS主成分分析
采用主成分分析(PCA)的方法分析风味与不同SMH之间的关系,通过主成分分析得到图2。PC累计比值越接近1,表示PCA模型的可靠性越强[18]。从图2中可以看出,第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的贡献率分别为43%和32.7%,累计贡献率达到75.7%,表明这两个主成分能够代表原始数据的绝大部分有效信息,分析所得数据能够反映出不同SMH的挥发性风味的总体特征。在PCA中样品之间距离近则代表差异小,距离远则代表差异明显。同一样品组内圆点呈现相互聚集,说明本次数据重复度好,数据结果准确。而不同SMH组间呈现相对分散状,图中豆粕主要在第三象限,风味蛋白酶组主要分布在第一象限,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组主要在第二象限,碱性蛋白酶组主要在第四象限,表明5组样品之间的挥发性风味物质存在明显差异。该结果与指纹图谱分析规律一致,表明本研究采用HS-GC-IMS对不同SMH的VOCs分析结果具有可行性。
图2 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-GC-IMS主成分分析
Fig.2 HS-GC-IMS principal component analysis plot of VOCs in soybean meal and different SMH
2.1.3 不同酶解物的挥发性化合物含量及OPLD-SA分析
HS-GC-IMS能够对VOCs进行可视化分析,可以快速检出较多分子小且含量较低的VOCs。因此,为进一步明晰4种SMH中的VOCs,利用HS-GC-IMS结合OPLD-SA对豆粕及4种SMH的挥发性化合物进行了分析。表2为HS-GC-IMS检测到的84种共有香气成分。以84个共有香气组分作为因变量,不同SMH作为自变量,通过OPLS-DA(图3a)可以实现4种SMH样品有效区分。本次分析中的自变量拟合指数
为0.983,因变量拟合指数
为0.997,模型预测指数Q2为0.989,R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受。经过200次置换检验,如图3b所示,Q2回归线与纵轴的相交点小于0,说明模型不存在过拟合,模型验证有效[19],该结果可用于SMH香气的不同蛋白酶鉴别分析。
图3 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-GC-IMS载荷得分图、模型交叉验证结果和VIP值
Fig.3 OPLS-DA,permutation test and VIP predictive in HS-GC-IMS spectra of VOCs in soybean meal and different SMH
表2 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-GC-IMS分析结果
Tab.2 Results of HS-GC-IMS analysis of VOCs in soybean meal and different SMH
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对分子质量保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶11,8-桉叶醇MC470-82-6桉树、草药、樟脑154.31027.3636.9311.29282(1.06±0.08)e(7.23±0.64)a(0.75±0.02)b(1.02±0.12)b(1.36±0.18)b21,8-桉叶醇DC470-82-6桉树、草药、樟脑154.31023.7629.0191.749290.09e(0.23±0.02)b0.11c(0.12±0.01)c(0.31±0.04)a31-丁醇MC71-36-3甜、醋、威士忌74.1645.9196.4821.17475(1.18±0.18)c(1.08±0.09)c(2.42±0.09)a(2.20±0.06)a(1.48±0.18)b41-丁醇DC71-36-3甜、醋、威士忌74.1643.2195.1191.38602(0.19±0.08)c0.12c(0.60±0.01)a(0.42±0.01)b(0.45±0.08)b51-庚醇C111-70-6发霉的、绿叶、木本、牡丹116.2970.2522.4431.37728(0.07±0.05)d(0.52±0.05)a(0.11±0.01)c(0.15±0.01)c(0.27±0.05)b61-辛醇C111-87-5蜡质、橙子、玫瑰130.21064.8727.471.46659(0.06±0.03)d(0.52±0.04)a(0.16±0.02)c(0.29±0.03)b(0.23±0.03)bc71-戊醇C71-41-0刺鼻的、发酵、酒精88.1749.4259.6511.25371(0.27±0.08)d(0.70±0.01)c(1.29±0.04)a(0.90±0.03)b(0.53±0.08)d81-戊烯-3-醇C616-25-1辣根、萝卜、菊花86.1720.6239.4231.36023(0.07±0.02)b(0.06±0.01)b(0.14±0.01)a(0.11±0.01)a(0.11±0.02)a91-丙硫醇MC107-03-9卷心菜、天然气、洋葱76.2614.2181.7581.16619(1.09±0.14)b(0.36±0.02)c(1.70±0.01)a(1.22±0.05)b(1.19±0.14)b101-丙硫醇DC107-03-9卷心菜、天然气、洋葱76.2616.8182.8941.35995(0.18±0.04)d(0.28±0.01)c(0.56±0.01)a(0.31±0.01)c(0.48±0.04)b112-乙基-1-己醇C104-76-7柑橘、花卉、清新130.21028.7640.0811.391331.49a(1.76±0.15)a(1.09±0.03)b(1.02±0.03)b1.79a122-呋喃甲硫醇MC98-02-2咖啡、脂肪114.2911.2428.5421.09246(1.09±0.18)ab(0.95±0.05)b(1.22±0.03)ab(1.43±0.20)a(1.25±0.18)ab
续表2
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对分子质量保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶132-呋喃甲硫醇DC98-02-2咖啡、烘焙、脂肪114.2908.7425.0331.34575(3.66±0.12)b(7.25±1.12)a(3.04±0.22)b(3.43±0.28)b(3.90±0.86)b142-呋喃甲醇C98-00-0酒精、发霉的、甜味、焦糖98.1855.5357.8291.35693(0.48±0.13)b(1.43±0.12)a(0.26±0.02)c(0.34±0.02)c(0.70±0.13)b152-甲基-1-丁醇C137-32-6酒精、脂肪88.1777.7281.9331.46562(0.67±0.13)c(1.46±0.06)a(1.00±0.23)b(1.04±0.07)b(0.90±0.13)b16乙醇MC64-17-5酒精46.1427.1124.2281.04009(0.69±0.23)b(0.34±0.17)c(2.14±0.08)a(2.23±0.09)a(0.95±0.23)b17乙醇DC64-17-5酒精46.1432.7125.4081.14922(1.18±0.11)c(0.13±0.02)d1.90b(2.19±0.03)a(1.48±0.11)c182-乙氧基乙醇C110-80-5-90.1706.5230.2651.093740.12bc(0.18±0.05)b(0.09±0.01)c(0.12±0.02)bc0.36a19异丙醇MC67-63-0酒精、发霉的、木本60.1500.5141.9091.20896(0.11±0.02)c(0.42±0.02)ab(0.46±0.04)a(0.38±0.07)ab(0.32±0.02)b20异丙醇DC67630酒精、发霉的、木本60.1482.4137.0631.0906(0.02±0.01)c(0.19±0.01)a(0.16±0.01)b0.14b(0.19±0.01)a21异戊醇C123-51-3酒精、威士忌、果味88.1768.9274.7441.25179(0.12±0.02)c0.20b(0.54±0.04)a(0.48±0.02)a(0.26±0.02)b22正己醇MC111-27-3酒精、脂肪102.2879.6386.5241.33075(0.38±0.05)d(1.44±0.18)b(2.10±0.06)a(1.61±0.12)b(0.60±0.10)c23正己醇DC111-27-3酒精、脂肪102.2875.5381.4451.626930.09d(0.23±0.01)c(2.26±0.06)a(1.78±0.11)b(0.18±0.04)c242-辛醇C123-96-6清新、辛辣、木本、草药130.21004.9589.051.44001(1.18±0.18)a(0.71±0.10)b(0.36±0.02)b(0.42±0.03)b(1.29±0.28)a253-辛醇C589-98-0泥土、蘑菇、草药、柑橘130.2996.7572.5171.38418(0.19±0.02)a(0.20±0.02)a(0.21)a(0.24±0.02)a(0.25±0.04)a醇类合计(25种)15.7327.9924.6723.5920.83261-辛烯-3-酮C4312-99-6草药、蘑菇、泥土126.2985.6550.8461.28334(5.54±0.45)a(5.32±0.54)b(1.45±0.07)d(1.15±0.11)d(3.25±0.68)c272,3-丁二酮C431-03-8黄油、甜味、焦糖86.1585.2169.8331.16288(2.12±0.65)a(0.66±0.13)c(1.88±0.05)b(1.54±0.03)b(0.40±0.02)d282,3-戊二酮C600-14-6刺鼻的、甜味、黄油100.1705.8229.8511.20657(4.18±0.46)a(0.28±0.04)b(0.20±0.10)b(0.17±0.02)b(0.53±0.10)b292-丁酮C78-93-3类似丙酮、果味、樟脑72.1627.5187.7041.07332(5.13±0.34)a(0.06±0.01)b0.13b(0.14±0.01)b(0.12±0.02)b30丁酮C78-93-3类似丙酮、果味、樟脑72.1548.3156.5081.04314(3.58±0.56)c(0.69±0.18)e(4.69±0.17)b(5.37±0.12)a(2.87±0.61)d312-庚酮MC110-43-0果味、辣的、草药、椰子114.2902.4416.2451.25748(2.31±0.05)d(3.86±0.62)c(3.42±0.05)c(2.72±0.01)d(5.00±0.70)b322-庚酮DC110-43-0果味、辣的、草药、椰子114.2901.7415.3671.63109(4.14±0.02)a(3.98±0.61)b(2.68±0.02)b(1.59±0.13)c(2.45±0.46)bc332-壬酮C821-55-6清新、甜味、草药142.21087.4789.0071.40458(4.18±0.02)a(0.40±0.03)b(0.16±0.02)b(0.14±0.01)b(0.12±0.02)b342-丙酮C67-64-1苹果、梨58.1498.8141.431.11034(2.17±0.01)a(0.09±0.03)c(0.40±0.02)b(0.48±0.03)b(0.32±0.06)b354,5-二氢-3(2H)-苯噻酮C1003-04-9蒜、肉、蔬菜102.2955.1496.3691.17722.19a0.05c0.08b0.07b(0.05±0.01)c36异亚丙基丙酮C141-79-7刺鼻的、蔬菜98.1808.4309.1621.45366(4.12±0.03)a(0.37±0.06)c(1.37±0.08)b(1.27±0.08)b(0.88±0.12)b
续表2
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对分子质量保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶酮类合计(11种)39.6615.7616.4614.6415.99372-己烯醛C505-57-7甜味、杏仁、果味、苹果98.1846347.2931.17553(0.58±0.01)a(0.22±0.04)c(0.60±0.01)a(0.51±0.01)ab(0.43±0.10)b382-甲基丙醛MC78-84-2清新、花卉72.1531.4151.031.09736(0.42±0.03)a(0.05±0.01)c(0.45±0.03)a(0.27±0.01)b(0.36±0.08)ab392-甲基丙醛DC78-84-2清新、花卉72.1535.1152.2041.28192(1.12±0.03)a(0.24±0.02)d(1.14±0.03)a(1.00±0.04)b(0.54±0.08)c40反-2-辛烯醛C2548-87-0清新、黄瓜、脂肪126.21064.5726.7431.33746(0.24±0.01)b(0.15±0.01)c(0.28±0.01)b(0.36±0.02)a(0.16±0.02)c413-甲基-2-丁烯醛MC107-86-8甜味、果味、刺鼻的、坚果84.1798.5300.0361.10835(0.62±0.04)a(0.86±0.04)a(0.69±0.04)a(0.76±0.05)a(0.74±0.13)a423-甲基-2-丁烯醛DC107-86-8甜味、果味、刺鼻的、坚果84.1795.9297.671.33688(2.23±0.15)b(5.63±0.78)a(2.25±0.15)b(3.06±0.18)b(3.31±1.07)b43苯甲醛MC100-52-7甜味、苦杏仁、樱桃106.1983.1546.1361.14946(2.74±0.35)a(1.81±0.21)b(2.77±0.35)a(1.45±0.02)b(2.94±0.35)a44苯甲醛DC100-52-7甜味、苦杏仁、樱桃106.1982.9545.8641.46612(0.92±0.03)a(0.71±0.11)b(1.00±0.03)a(0.54±0.02)b(1.17±0.19)a45丁醛MC123-72-8刺鼻的、可可、发霉的72.1584.5169.5421.1267(0.02±0.01)b(0.48±0.02)a(0.09±0.01)b(0.16±0.01)b(0.16±0.09)b46丁醛DC123-72-8刺鼻的、可可、发霉的72.1587.7170.7811.26229(1.87±0.15)b(3.65±0.13)a(2.16±0.15)b(3.07±0.14)ab(2.35±0.67)b47庚醛C111-71-7脂肪、清新114.2907.8423.7951.32082(2.23±0.03)a(0.73±0.02)c(2.87±0.03)a(2.75±0.16)a(1.96±0.16)b48己醛MC66-25-1脂肪、草木100.2792.2294.3871.24536(2.44±0.05)a(0.86±0.07)c(2.87±0.05)a(2.80±0.09)a(1.67±0.25)b49己醛DC66-25-1脂肪、草木100.2786.5289.4441.56504(15.42±0.24)a(7.24±1.04)b(15.88±0.24)a(16.95±0.33)a(16.06±2.23)a50N-壬醛C124-19-6玫瑰、清新、橙皮142.21087.6789.5061.478550.14b(0.97±0.14)a0.17b(0.18±0.01)b(0.20±0.01)b51苯乙醛C122-78-1甜味、花卉、风信子120.21010.9601.311.25716(6.92±0.11)b(8.85±0.23)a(7.05±0.11)b(6.38±0.18)c(8.71±0.35)a52丙醛C123-38-6酒精、威士忌、可可58.1478.9136.1641.04835(1.19±0.01)b(0.18±0.04)d(1.29±0.01)b(1.55±0.06)a(0.58±0.13)c醛类合计(16种)39.1041.5641.5641.7941.34532-甲基丙基丁酸酯C539-90-2甜味、果味、甜酒144.2956.9499.3221.34298(0.13±0.01)d(0.64±0.04)a(0.62±0.03)a(0.51±0.04)b(0.32±0.01)c543-甲基丁基乙酸酯C123-92-2果味、香蕉130.2848.8350.3551.29781(0.23±0.01)c(2.18±0.32)a(0.54±0.02)b(0.65±0.06)b(0.91±0.22)b553-甲基-2-甲基丙基丁酸酯C589-59-3甜味、苹果158.21005589.2751.37461(0.32±0.01)b(0.33±0.01)b(0.41±0.01)b(0.38±0.03)b(0.88±0.11)a562-甲基丁酸丁酯C15706-73-7果味、草药158.21045.3678.8051.37256(0.02±0.01)c(0.27±0.03)a(0.11±0.01)b(0.11±0.02)b(0.15±0.01)b572-甲基丙酸乙酯C97-62-1甜味、果味、酒精116.2762.1269.3891.18482(0.32±0.02)b(0.28±0.05)b(0.46±0.02)a(0.30±0.01)b(0.43±0.02)a583-甲基丁酸乙酯C108-64-5果味、甜味、菠萝130.2856.1358.5251.25324(0.22±0.03)c(0.42±0.05)b(0.52±0.03)ab(0.45±0.01)b(0.67±0.09)a59丁酸乙酯C105-54-4果味、菠萝116.2454.4130.2011.19349(0.43±0.05)c(0.53±0.09)b(1.43±0.15)a(1.44±0.10)a(1.73±0.19)a60丁酸异戊酯C106-27-4果味、杏、梨158.21052.6696.6991.42078(0.13±0.01)c(0.50±0.04)a(0.23±0.01)b(0.29±0.03)b(0.26±0.06)b
续表2
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对分子质量保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶61乙酸异丁酯C110-19-0甜味、果味、香蕉116.2760.42681.636760.02c(0.22±0.02)a0.07b0.05b(0.08±0.02)b62甲酸异戊酯C110-45-2李子、醋栗116.2776.1280.6151.65795(0.46±0.02)d(3.85±0.02)a(2.46±0.04)c(3.06±0.08)b(4.19±0.43)a633-甲基丁酸戊酯C25415-62-7果味、苹果172.31157.61015.5041.474520.02d(0.54±0.01)a0.18ab(0.19±0.01)b(0.15±0.02)c64乙酸丙酯C109-60-4芹菜、果味、树102.1706.9230.5211.163880.03b(0.18±0.10)a(0.09±0.10)a(0.06±0.01)ab(0.06±0.01)ab65乙酸丙酯DC109-60-4芹菜、果味、树102.1703.3228.2941.49693(0.14±0.02)c(0.09±0.01)c(0.67±0.03)a(0.45±0.03)b(0.09±0.01)c酯类合计(13种)2.4710.037.797.949.92662-甲基丁酸C116-53-0酸味、芝士、奶酪102.1865.8369.7181.21744(0.13±0.01)c(0.23±0.01)b(0.44±0.01)a(0.42±0.01)a(0.24±0.01)b672-甲基丙酸MC79-31-2-88.1744.1255.7351.15324(0.23±0.04)b(0.63±0.22)a(0.20±0.01)b(0.25±0.04)b(0.30±0.09)b682-甲基丙酸DC79-31-2-88.1737.4250.9191.372780.02c0.06b(0.18±0.02)a(0.17±0.01)a(0.08±0.01)b69醋酸C64-19-7酸味、醋60.1621.8185.1091.0472(0.15±0.04)d(0.22±0.03)d(0.93±0.02)b(1.57±0.03)a(0.42±0.06)c70丁酸C107-92-6醋酸、奶酪、黄油88.1831.2331.6321.16461(0.03±0.04)b(0.18±0.06)a(0.14±0.02)a(0.13±0.01)a(0.11±0.02)ab71庚酸C111-14-8腐臭、酸味130.21111.8861.5371.37934(0.05±0.01)c(0.18±0.01)b(0.15±0.01)b(0.17±0.01)b(0.44±0.07)a72丙酸C79-09-4乳品、果味74.1723.7241.4721.10814(0.02±0.01)c(0.15±0.05)b(0.19±0.01)b(0.13±0.03)b(0.30±0.02)a酸类合计(7种)0.631.652.232.841.89732,6-二甲基吡嗪C108-50-9可可、坚果、烤肉108.1924.6448.0461.13511(0.03±0.01)e(0.10±0.01)d(0.22±0.01)b0.24a(0.19±0.01)c742-乙基-5-甲基吡嗪C13360-64-0-122.21023.6628.7731.66986(0.39±0.07c(2.93±0.41)a(1.81±0.19)b(1.94±0.15)b(1.39±0.17)b75三甲基吡嗪C14667-55-1坚果、可可、榛子122.21005.9591.0011.15979(0.23±0.04)c(0.33±0.04)b(0.48±0.02)a(0.36±0.01)b(0.37±0.03)b吡嗪类合计(3种)0.653.362.512.541.9576莰烯C79-92-5木本、草药、冷杉针136.2939.9471.5731.21522(0.03±0.01)c0.08b(0.09±0.01)b0.08b(0.11±0.01)a77异戊二烯C78-79-5-68.1530.9150.8821.2106(0.31±0.05)c(0.33±0.02)c(0.51±0.05)bc(0.90±0.01)ab(1.04±0.31)a78苯乙烯C100-42-5甜味、醋、花卉、塑胶104.2905.2420.0761.40022(0.23±0.03)b(0.95±0.12)a(0.70±0.06)a(1.02±0.04)a(1.17±0.35)a烯类合计(3种)0.571.361.322.32792-乙基呋喃C3208-16-0可可、麦芽96.1764.5271.2161.28985(0.24±0.03)c(0.85±0.03)a(0.21±0.04)c(0.30±0.04)bc(0.41±0.12)b802-正丁基呋喃C4466-24-4果味、酒精、辛辣124.2890.4400.2671.18282(0.23±0.02)c(0.27±0.02)c(0.43±0.01)a(0.35±0.02)b(0.38±0.02)b812-戊基呋喃C3777-69-3果味、泥土、蔬菜138.2971.7525.1561.25784(0.03±0.01)c(0.18±0.03)b(0.26±0.01)a(0.24±0.01)ab(0.27±0.04)a呋喃类合计(3种)0.511.30.90.891.06
续表2
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对分子质量保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶822-乙酰噻唑C24295-03-2坚果、爆米花、榛子127.21025.6633.2091.46499(0.32±0.02)c(1.13±0.11)a(0.40±0.02)b(0.52±0.06)b(1.00±0.21)a833-丁烯腈C109-75-1-67.1652.2199.6331.26563(0.23±0.07)d(4.43±0.17)a(1.80±0.17)c(2.89±0.20)bc(3.19±0.78)b84二丙基二硫醚C629-19-6泥土、洋葱150.31095810.9021.47228(0.13±0.03)c(0.37±0.03)ab(0.29±0.05)b(0.29±0.04)b(0.44±0.08)a其他(3种)0.685.932.493.74.63总计(84种)10010099.9199.9399.93
注:M、D分别代表物质的单体、二聚体;“-”代表无明显特征气味;空白代表未检出;数据表示为平均值±标准偏差,n=3;同列数据不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
为了进一步分析不同VOCs对豆粕及不同SMH的贡献率,根据P<0.05且VIP值大于1的标准,筛选出33种不同SMH的差异香气物质(图3c),这些差异香气物质可能对分析不同SMH香气特征具有重要作用。4种SMH的香气组分种类与豆粕相似,但各类物质总含量有差异。豆粕中含量最高的风味物质是酮类(1-辛烯-3-酮、2-丁酮、2,3-戊二酮等),醛类(苯乙醛、己醛、3-甲基-2-丁烯醛等),其次是醇类(1,8-桉叶醇、2-呋喃甲硫醇和2-甲基-1-丁醇等)。文献[20]研究证明,酮类物质是大豆榨油产出豆粕过程中残余油脂的氧化和美拉德反应的产物,一般对风味具有修饰作用,而醛类物质是豆粕中脂质氧化降解产生异味的主要物质,具有难闻的油腻味。醇类物质是在豆粕的加工和储存期间,由于压榨后豆粕中的油脂不能完全去除,残余油脂中的不饱和脂肪酸被氧化酶(Loxl、Lox2、Lox3)氧化成氢过氧化物,再被氢过氧化物裂解酶或氧化还原酶催化产生的,使豆粕产生特殊风味[21]。经蛋白酶酶解后,酮类物质显著降低而醛类、醇类和酯类物质明显增加,酯类物质是在酶解过程中通过酸和醇的酯化反应形成的,是SMH中的主要致香物质,具有水果香味,能保持较长时间,是不可缺少的香气和风味成分[5],说明酶解可以显著改善豆粕的不良风味,赋予豆粕特殊的风味,有利于对豆粕的再加工。
2.2.1 HS-SPME-GC-MS聚类热图
利用HS-SPME-GC-MS对豆粕以及不同SMH进行检测,鉴定出VOCs共103种,具体结果见表3。HS-SPME-GC-MS鉴定出的化合物主要包括酮类、醇类、醛类等物质。实验中共检测到17种酮类物质,相对含量变化范围为1.07%～7.56%,其中木瓜蛋白酶组中酮类物质的总相对含量显著高于豆粕。3-辛烯-2-酮(1.71%)、3,5-辛二烯-2-酮(1.14%)和3-羟甲基壬烷-2-酮(0.74%)具有果香和木香等香味[22],以上物质在木瓜蛋白酶组中相对含量最高,对风味的形成和增强有一定的贡献[23]。文献[20]研究木瓜蛋白酶酶解豆粕过程中的挥发性风味物质中产生的酮类化合物与本研究结果相似,酮类化合物是酶解过程中由多不饱和脂肪酸热氧化、氨基酸降解产生的,一般对风味具有修饰作用。3,5-辛二烯-2-酮具有水果香,仅在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组中检出,该物质的存在对SMH的风味产生较好影响[24]。文献[25]研究发现醇类物质一般具有独特的清香、果香、花香和甜味等令人愉悦的风味,其中不饱和醇的阈值相对较低,可能对SMH风味的形成具有一定的作用。实验中共检测到23种醇类物质,相对含量变化范围为0.36%～18.9%。与豆粕相比SMH的醇类物质含量有显著变化,其中风味蛋白酶组中检出的醇类物质相对含量最多,2-乙基己醇(2.41%)、肉豆蔻醇(0.75%)和十四烷醇(0.76%)具有泥土气味,以上物质在风味蛋白酶组中相对含量最高,可增强SMH的脂肪香味[26]。2-乙基己醇具有淡花香和甜味,在中性蛋白酶组中也被检出且含量较高,可能对SMH的风味有一定影响[27]。醇类化合物主要来源于酶解过程中氨基酸的转化,由醛进一步分解形成,大部分都具有令人愉快的花香和草本香特征[28]。实验中共检出7种醛类物质,相对含量变化范围为1.55%～13.61%。只有风味蛋白酶SMH醛类物质含量升高,其余均降低,壬醛(4.62%)、癸醛(2.62%)和正己醛(2.73%)在风味蛋白酶组中相对含量最高,主要呈现出清香的风味[29],一般来源于酶解过程中氨基酸的施特雷克尔降解反应或脂肪的氧化降解,其中C6～C9的饱和醛和不饱和醛具有清香、果香和脂香味,且阈值很低,对酶解物的整体气味特征具有重要贡献[30]。
表3 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-SPME-GC-MS分析结果
Tab.3 HS-SPME-GC-MS analysis of soybean meal and VOCs of different SMH
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶PVIP值1壬醛124-19-6蜡质、玫瑰、橙皮(1.69±0.03)b-(1.59±0.06)b(0.94±0.02)c(4.62±0.09)a0.011.0222,4-二甲基苯甲醛15764-16-6樱桃、杏仁、香料、香草---(0.61±0.01)b(1.04±0.04)a0.011.043癸醛112-31-2蜡质的橙皮,柑橘类的花香--(0.74±0.033)b-(2.62±0.04)a0.041.0341H-1,2,3-噻唑-5-甲醛16681-68-8---0.38±0.01--<0.011.045正己醛66-25-1草叶、果味(4.01±0.08)a---(2.73±0.04)b0.011.056戊二醛111-30-8草药味----1.76±0.53<0.011.007十二醛112-54-9蜡质、柑橘、花香----0.84±0.040.031.05醛类合计(7种)5.70-2.711.5513.618肉豆蔻醇112-72-1果香味、鸢尾花、椰子-(0.36±0.03)b--(0.75±0.02)a0.021.0592-乙基环丁醇35301-43-0----2.01±0.02-<0.011.02102-[(2R,5S)-5-乙烯基-5-甲基氧杂环戊烷-2-基]丙醇5989-33-3泥土味---0.94±0.04-<0.011.02111,2-庚二醇3710-31-4----0.93±0.02-0.011.02121,1-二烯丙基乙醇25201-40-5----0.63±0.01-<0.011.02131-(2-甲氧基苯基)乙醇7417-18-7----0.62±0.01-<0.011.02141,2-二甲基-3-(1-甲基乙烯基)-[1R-(1α,2β,3α)]-环戊醇803-35-5----0.73±0.01-<0.011.0215环十二烷甲醇1892-12-2----0.52±0.02-<0.011.02162-异丙基-5-甲基-1-庚醇91337-07-4---(1.08±0.07)a(0.52±0.02)b-<0.011.02172-氨基-1-甲基-4-(1-甲基乙基)环己醇6756-99-6----(2.53±0.06)a(0.56±0.04)b0.031.02182,2,4,4-四甲基-1,3-环丁二醇3010-96-6---1.12±0.06--0.011.0419反式-2-己烯-1-醇928-95-0果味、未成熟的香蕉--1.23±0.06--<0.011.04202,3-二甲基-3-己醇4166-46-5---0.73±0.01--<0.011.04212-乙基己醇104-76-7柑橘、新鲜花香--(2.07±0.10)b-(2.41±0.09)a0.021.00221,3-二氧杂烷-2-甲醇5694-68-8---0.36±0.01--<0.011.0423反式-2-十二烯-1-醇69064-37-5油性脂肪--0.54±0.04--0.021.04242,4-二甲基-2-噁唑烷-4-甲醇39986-37-3-----1.92±0.07<0.011.05252-甲基环庚醇16240-38-3-----0.55±0.04<0.011.05262-异丙基-5-甲基环己烷-1-醇490-99-3-----0.56±0.04<0.011.0527癸醛-4a-醇3574-58-1-(0.82±0.02)a---(0.54±0.04)b<0.011.05
续表3
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶PVIP值283,5-二甲基吡唑-1-甲醇85264-33-1-----0.85±0.03<0.011.0529十四烷醇112-44-7蜡质、肥皂、花、柑橘类----0.76±0.03<0.011.05301-丁基-3-甲基-2-环己烯-1-醇122364-47-0-----0.55±0.02<0.011.05醇类合计(23种)0.820.367.139.4318.9311,1-二甲基环己烷590-66-9----0.65±0.04-0.031.02323-(2-羟丙基)-5-甲基-2-恶唑烷3375-84-6----0.69-<0.011.0233异壬烷16747-26-5---(1.31±0.08)a(0.67±0.03)b-0.011.02342-甲基-2-乙烯基-1,3-二氧戊烷26924-35-6---0.46±0.03--<0.011.0435二羟甲基氨基甲烷561-77-3-(0.29±0.05)b-(0.62±0.01)a--<0.011.04361,5-二氮杂环[3.1.0]己烷13090-31-8---2.80±0.07--<0.011.04371,3-二甲氧基丙烷17081-21-9-----0.46±0.03<0.011.05烷烃类合计(7种)0.29-5.192.010.46382-异丙基-2,3-二甲基丁酸23119-04-2----0.62±0.01-<0.011.0239正癸酸334-48-5脂肪、柑橘---(0.55±0.02)b(0.84±0.03)a0.011.0440乙基异丙基硼酸98544-74-2---0.37±0.02--0.011.0441月桂酸143-07-7脂肪味--(0.63±0.02)a-0.61a<0.011.00羧酸类合计(4种)--1.001.171.45423-辛烯-2-酮1669-44-9草本植物、甜蘑菇、蓝莓-(0.54±0.03)c(0.83±0.02)b(1.71±0.08)a-0.031.03436,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮689-67-8花香-(0.53±0.03)b-(0.66±0.03)a-0.011.01443-甲氧基-5-甲基-2-环戊烯-1-酮7180-60-1----0.37±0.02-0.011.02455-(环己基甲基)吡咯烷-2-酮14293-08-4----0.53±0.04-0.011.02463-羟甲基壬烷-2-酮67801-33-6杂草、泥土、草药---0.74±0.03-<0.011.02473,5-辛二烯酮,3,5-辛二烯-2-酮38284-27-4果味、蘑菇(6.05±0.11)a-(0.55±0.03)c(0.74±0.01)b-<0.011.01483,5-辛二烯-2-酮30086-02-3果香、绿草味--(0.93±0.02)b(1.14±0.07)a-0.011.01492-丁基环己酮1126-18-7花香果味---0.73±0.03-<0.011.02504′-羟基-2′-甲基苯乙酮875-59-2----0.94±0.02-<0.011.02512″,4″-二羟基-3″-甲基丁苯酮93970-93-5---0.52±0.01--0.051.04521H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4(3H,5H)-二酮65996-50-1---0.52±0.01--<0.011.04
续表3
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶PVIP值536-甲基-2-庚-4-酮49852-35-9---0.47±0.01--<0.011.04542,2-双乙酰氧基-苯乙酮5062-30-6-----0.56±0.03<0.011.05552,4,6-环庚三烯-1-酮539-80-0-----0.55±0.040.021.05564-[吡咯烷-2-酮-5-基]丁烷-2-酮117155-74-5-----0.74±0.03<0.011.05572,6-二(叔丁基)-4-羟基-4-甲基-2,5-环己烯-1-酮10396-80-2-----0.46±0.04<0.011.05582,3-庚烷二酮351-6-3黄油----1.42±0.05<0.011.05酮类合计(17种)6.051.073.827.563.7359S-(4-氰基苯基)N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯19290-43-8----0.46±0.04-0.011.02601,5-二甲基-1-乙烯基-4-己烯基丁酸酯78-36-4佛手柑、果味、香蕉、浆果---1.01±0.02-<0.011.02614,6-二甲基壬酸甲酯55955-66-3----1.42±0.06-0.011.02622-乙基庚酸甲酯816-63-7----0.72±0.01-<0.011.0263异硫氰酸苄酯622-78-6豆瓣菜---6.39±0.11-0.021.0264甲基硫代乙酸甲酯16630-66-3硫磺味、熟土豆、烤坚果、热带水果--0.56±0.04--<0.011.04652-甲基辛酸甲酯2177-86-8---(0.75±0.04)b-(0.85±0.03)a0.011.00662,4-二甲基-己酸甲基酯14251-44-6---2.40±0.06--<0.011.04672,2,-二甲基乙酰乙酸甲酯38923-57-8---1.07±0.08--0.021.04682-甲基-丙酸3-羟基-2,2,4-三甲基戊基酯77-68-9---0.47±0.02--0.011.0469(1R,2S,5R)-(-)-薄荷基(S)-对甲苯亚磺酸酯1517-82-4---0.72±0.01--<0.011.0470马来酸二丁酯105-76-0---0.73±0.01--<0.011.04712-甲氧基乙基-2-乙基己酸酯205983-99-9---0.75±0.04--0.021.0472邻苯二甲酸二乙酯84-66-2---0.51±0.01--<0.011.0473乙基己酸乙基己酯7425-14-1果味--0.63±0.02--0.011.0474二氢茉莉酮酸甲酯24851-98-7花香、茉莉花--0.85±0.03--<0.011.0475四氢糠醇丙酸酯637-65-0油漆、果味、紫罗兰叶--0.46±0.02--0.011.0476邻苯二甲酸二异丁酯84-69-5---(1.70±0.06)a-(0.94±0.02)b0.011.01酯类合计(18种)--11.6010.001.7977异麦芽酚3420-59-5焦糖味---0.45±0.04-0.031.02784-叔丁基-2-甲基噻酚15570-10-2----0.63±0.02-<0.011.02792-(2-甲基烯丙基)苯酚20944-88-1----0.75±0.02-<0.011.0280羟基二氢麦芽酚28564-83-2-----0.45±0.040.031.05812-甲氧基-4-乙烯苯酚7786-61-0丁香、康乃馨、胡椒味、烟熏、木本----0.54±0.03<0.011.05
续表3
序号挥发性化合物CAS号气味特征相对含量/%豆粕碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶风味蛋白酶PVIP值824-丙基甲苯1074-55-1-----0.53±0.04<0.011.05酚类合计(6种)---1.831.5283N,N-二丁基甲酰胺761-65-9---(0.53±0.02)a-(0.45±0.03)b<0.011.0584烯丙基胺107-11-9-----1.71±0.08<0.011.0585N-乙基异丙基胺19961-27-4-----0.53±0.020.011.05862-(1h-咪唑-4-基)-1-甲基-乙胺2hcl6986-90-9-----1.51±0.06<0.011.0587正丁胺109-73-9氨状腥味--0.94±0.01--<0.011.04883-甲基环己胺6850-35-7-(0.14±0.01)b--(0.53±0.01)a-<0.011.0289庚酰胺628-62-6----2.48±0.05-0.031.02胺类合计(7种)-0.14-1.473.014.57904-甲氧基-1-戊烯98386-09-5----0.53±0.03-<0.011.02912-环戊烯-1-基醚15131-55-2----0.53±0.04-0.011.02922-癸基吡啶74421-02-6----(0.66±0.02)a(0.65±0.03)a0.021.0393去乙基-去异丙基-2-羟基阿特拉津645-92-1----0.55±0.03-<0.011.02941,1-二丙基肼4986-50-9----2.63±0.08-<0.011.02952,4,6-三氨基嘧啶1004-38-2----0.54±0.03-<0.011.02962-叔丁基-4-羟基茴香醚88-32-4微焦味、微酸味---0.74±0.04-<0.011.02972-叔丁基-2-甲基-1,3-二氧戊环6135-54-2---0.45±0.02--<0.011.04983,5-二氨基-1,2,4-三氮唑1455-77-2---0.44±0.03--<0.011.04993-甲基吡唑1453-58-3---0.64±0.03--<0.011.041002-甲基-5-氨基-2H-四氮唑1553-84-0-----0.64±0.020.011.051013-羟基吡啶109-00-2-----1.05±0.050.011.051022-甲基-2-(4-甲基-3-亚甲基戊基)-1,3-二氧戊环66972-05-2-----2.42±0.050.021.051034,4-二甲基-2-咪唑并啉2305-59-1-----0.36±0.04<0.011.05其他(14种)--1.536.185.12
为观察到豆粕及不同SMH之间的差异对其进行聚类分析。以P<0.05且VIP值大于1的标准,筛选出103种差异风味物质的相对含量作为变量,得到聚类热图。结果如图4所示,4种SMH与豆粕做对照差异明显,可聚为3类,使其特征性物质可视化,碱性蛋白酶和中性蛋白酶组聚为一类,风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组各为一类。结合图4和表3可以看出,碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组中的烷烃类、酮类和胺类化合物种类较多,而仅有3-辛烯-2酮、6,10-2甲基-5,9-十一双烯-2-酮和肉豆蔻醇3种物质为碱性蛋白酶组的差异风味物质。风味蛋白酶组的差异风味物质中醛类和醇类化合物种类较多且相对含量较高,主要是因为风味蛋白酶同时具有内切蛋白酶与外切肽酶两种活性,会更大程度地将豆粕中的蛋白质和多肽降解为游离氨基酸,游离氨基酸可作为重要的风味物质和风味前体物质[31],在酶解过程中经一系列反应生成醛类和醇类化合物[32]。木瓜蛋白酶组的差异风味物质中吡啶类、呋喃类和胺类化合物种类较多且相对含量较高,可能是由于木瓜蛋白酶内切产生大量多肽片段,在酶解过程中经热降解会产生大量氨基,这些氨基经美拉德反应可以生成吡嗪、吡咯、吡啶等风味物质[33]。综合分析表明,风味蛋白酶和木瓜蛋白酶与豆粕相比相差最大,风味改善效果明显。
图4 豆粕及不同SMH中差异风味成分聚类热图
Fig.4 Heatmap of clustering of differential flavor components in soybean meal and different SMH
2.2.2 HS-SPME-GC-MS主成分分析
通过HS-SPME-GC-MS结果结合PCA分析,能够方便快捷地对不同SMH进行区分,其结果如图5所示。其中PC1和PC2的累计方差贡献率为78.5%,可反映数据的绝大部分信息。由图5可知,豆粕与碱性蛋白酶组在图中相距较近,其余样品在图中间隔较大、且不交叉重叠,表明豆粕与碱性蛋白酶酶解物的挥发性风味特征具有一定相似性,其余样品之间风味具有明显差异。以上结果良好地验证了聚类热图的结果,即风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物与豆粕相比相差最大,风味改善效果明显。
图5 豆粕及不同SMH中VOCs的HS-SPME-GC-MS主成分分析图
Fig.5 HS-SPME-GC-MS principal component analysis plot of VOCs in soybean meal and different SMH
由表2可知,不同SMH采用GC-IMS检测出84个共有香气成分,其中醇类化合物25种、醛类化合物16种、酮类化合物11种、酯类化合物13种、酸类化合物7种、吡嗪类化合物3种、烯烃类化合物3种、呋喃类化合物3种和其他类化合物3种。这些有机物分子C链大多在C2～C10之间,醛类化合物是SMH主要的挥发性成分,相对含量为39.10%～41.79%。由表3可知,不同SMH采用GC-MS共检测出103种挥发性成分,包括醛类7种、醇类23种、烷烃类7种、酸类4种、酮类17种、酯类18种、酚类6种、胺类7种以及其他类化合物14种。GC-MS和GC-IMS两种检测方法检出的基础风味物质种类基本一致,由图6可知,SMH共有风味物质为4～10 种,多为2,3-戊二酮、2-乙基-1-己醇、2-庚酮、2-壬酮、2-戊基呋喃、苯甲醛、庚酸、己醛、壬醛、乙酸丙酯。其中HS-SPME-GC-MS法检测出的挥发性风味化合物数量更多而HS-GC-IMS法可以检测出更多类型的化合物,是因为HS-SPME-GC-MS的数据库比HS-GC-IMS更加成熟,但是使用HS-SPME-GC-MS法样品前处理比较繁琐且容易失真[34]。而HS-GC-IMS法样品无需复杂的浓缩、富集,有利于保持风味物质的稳定,可广泛应用于不同挥发性成分和同分异构体区分以及对痕量物质检测具有高灵敏性[35]。因此两者结合取长补短,通过HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS相结合的分析方法可以更加方便、快捷、准确研究不同样品间的挥发性风味成分的差异。
图6 豆粕及不同SMH的HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS韦恩图
Fig.6 Soybean meal and different SMH HS-GC-IMS and HS-SPME-GC-MS VENN diagram
采用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS两种技术研究了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及风味蛋白酶酶解对豆粕挥发性风味成分的影响,并结合PCA、聚类热图和OPLS-DA分析不同SMH之间的风味差异。HS-GC-IMS定性检出84种已知挥发性组分,不同SMH在指纹图谱中各有特征峰区域,其中风味蛋白酶组的特征峰区域最大。PCA结果表明不同SMH之间的风味存在显著差异。偏最小二乘结果揭示了酶种类与挥发性化合物之间的相关性,基于P值与VIP值,筛选得到33种不同SMH的差异香气物质,发现经蛋白酶酶解后,酮类物质显著降低而醛类、醇类和酯类物质明显增加,说明酶解显著改善了豆粕的不良风味。HS-SPME-GC-MS鉴定出挥发性化合物103种,主要包括酮类、醇类、醛类等物质。筛选出差异风味物质进行聚类分析发现,碱性蛋白酶组的差异风味物质仅有3-辛烯-2酮、6,10-2甲基-5,9-十一双烯-2-酮和肉豆蔻醇3种。风味蛋白酶组的差异风味物质中醛类和醇类化合物种类较多且相对含量较高,木瓜蛋白酶组的差异风味物质中吡啶类、呋喃类和胺类化合物种类较多且相对含量较高。PCA和聚类热图结果表明不同蛋白酶酶解对豆粕的挥发性风味物质的种类和含量有显著影响,其中,风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对豆粕的风味改善最为显著。综合韦恩图结果说明HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS联合使用,可以弥补各自的局限性,更全面地描述样品风味特征,为不同蛋白酶酶解豆粕风味成分分析提供了客观依据。
[1] AMUTIA F,BINNER E,WILLIAMS P,et al.Oilseeds beyond oil:press cakes and meals supplying global protein requirements[J].Trends in Food Science &Technology,2020,100:88-102.
[2] PAULINO B N,SALES A,FELIPE L,et al.Recent advances in the microbial and enzymatic production of aroma compounds[J].Current Opinion in Food Science,2021,37:98-106.
[3] 范海茹,李淑英,许斌,等.内外切蛋白酶连续酶解制备豆粕鲜味肽的研究[J].中国调味品,2021,46(1):77-82.
FAN Hairu,LI Shuying,XU Bin,et al.Study on preparation of soybean meal umami peptides by continuous enzymatic hydrolysis[J].China Condiment,2021,46(1):77-82.(in Chinese)
[4] 王雨生,陈海华,王莹钰,等.超声波协同酶法制备香菇酶解液及其鲜味物质研究[J].中国食品学报,2015,15(9):134-141.
WANG Yusheng,CHEN Haihua,WANG Yingyu,et al.Preparation of mushroom hydrolysate by ultrasonic-enzyme synergistic method and studies on lts umami substances[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2015,15(9):134-141.(in Chinese)
[5] LI Meng,ZHANG Jialan,LI Li,et al.Effect of enzymatic hydrolysis on volatile flavor compounds of Monascus-fermented tartary buckwheat based on headspace gas chromatography-ion mobility spectrometry[J].Food Research International,2023,163:112180.
[6] 江连洲,佟晓红,刘宝华,等.酶种类对生物解离大豆蛋白酶解物功能性和苦味的影响[J].农业机械学报,2018,49(8):368-374.
JIANG Lianzou,TONG Xiaohong,LIU Baohua,et al.Effect of enzymatic species on function and bitterness of enzyme-assisted aqueous extraction soybean protein hydrolysates[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery,2018,49(8):368-374.(in Chinese)
[7] ZHENG Li,LI Da,LI Zhuolin,et al.Effects of bacillus fermentation on the protein microstructure and anti-nutritional factors of soybean meal[J].Letters in Applied Microbiology,2017,65(6):520-526.
[8] XIANG Longbie,ZHU Wenyang,JIANG Bo,et al.Volatile compounds analysis and biodegradation strategy of beany flavor in pea protein[J].Food Chemistry,2023,402:134275.
[9] YIN Liqing,LIU Zhihao,LU Xinghua,et al.Analysis of the nutritional properties and flavor profile of sweetpotato residue fermented with Rhizopus oligosporus[J].LWT,2023,174:114401.
[10] 单启梅,赵晓策,罗瑞明,等.滩羊肌肉在煮制过程中可挥发性化合物的变化[J].食品科学,2021,42(8):165-171.
SHAN Qimei,ZHAO Xiaoce,LUO Ruiming,et al.Change of volatile flavor compounds in Tan sheep muscle during cooking[J].Food Science,2021,42(8):165-171.(in Chinese)
[11] 王辉,田寒友,李文采,等.基于顶空气相色谱-离子迁移谱技术的冷冻猪肉贮藏时间快速判别方法[J].食品科学,2019,40(2):269-274.
WANG Hui,TIAN Hanyou,LI Wencai,et al.Fast discrimination of frozen pork stored for different periods using headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy (HS-GC-IMS)[J].Food Science,2019,40(2):269-274.(in Chinese)
[12] ARROYO-MANZANARES N,MART
N-G
MEZ A,JURADOCAMPOS N,et al.Target vs spectral fingerprint data analysis of Iberian ham samples for avoiding labelling fraud using headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry[J].Food Chemistry,2018,246:65-73.
[13] YU Min,HE Shudong,TANG Mingming,et al.Antioxidant activity and sensory characteristics of Maillard reaction products derived from different peptide fractions of soybean meal hydrolysate[J].Food Chemistry,2018,243:249-257.
[14] RODRíGUEZ-MAECKER R,VYHMEISTER E,MEISEN S,et al.Identification of terpenes and essential oils by means of static headspace gas chromatography-ion mobility spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2017,409(28):6595-6603.
[15] 于怀智,姜滨,孙传虎,等.顶空气相离子迁移谱技术对不同产地水蜜桃的气味指纹分析[J].食品与发酵工业,2020,46(16):231-235.
YU Huaizhi,JIANG Bin,SUN Chuanhu,et al.Analysis of nectarine odor fingerprints based on headspace-gas chromatography-ion mobilit spectroscopy[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(16):231-235.(in Chinese)
[16] LI Huamin,JIANG Dongqi,LIU Wenli,et al.Comparison of fermentation behaviors and properties of raspberry wines by spontaneous and controlled alcoholic fermentations[J].Food Research International,2019,128:108801.
[17] MEINLSCHMIDT P,SCHWEIGGERT-WEISZ U,BRODE V,et al.Enzyme assisted degradation of potential soy protein allergens with special emphasis on the technofunctionality and the avoidance of a bitter taste formation[J].LWT,2016,68:707-716.
[18] LIU Miao,WANG Jun,LI Duo,et al.Electronic tongue coupled with physicochemical analysis for the recognition of orange beverages[J].Journal of Food Quality,2012,35(6):429-441.
[19] YUN Jing,CUI Chuanjian,ZHANG Shihua,et al.Use of headspace GC/MS combined with chemometric analysis to identify the geographic origins of black tea[J].Food Chemistry,2021,360:130033.
[20] WENG Zebin,SUN Lu,WANG Fang,et al.Assessment the flavor of soybean meal hydrolyzed with Alcalase enzyme under different hydrolysis conditions by E-nose,E-tongue and HS-SPME-GC-MS[J].Food Chemistry:X,2021,12:100141.
[21] ZHOU Dan,PAN Yun,YE Jing,et al.Preparation of walnut oil microcapsules employing soybean protein isolate and maltodextrin with enhanced oxidation stability of walnut oil[J].LWT,2021,83:292-297.
[22] ZHOU Y Q,WANG Z J.Extraction and analysis on fishy odor-causing compounds in the different part of carp[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2006,34(9):165-167.
[23] 冯涛,赵宇,张治文,等.L-阿拉伯糖与氨基酸美拉德反应挥发性风味物质分析[J].食品科学,2019,40(8):213-217.
FENG Tao,ZHAO Yu,ZHANG Zhiwen,et al.Analysis and formation mechanism of volatile flavor substances in Maillard reaction productsfrom L-Arabinose and amino acid[J].Food Science,2019,40(8):213-217.(in Chinese)
[24] 徐永霞,曲诗瑶,李涛,等.不同蛋白酶对蓝蛤酶解液风味特性的影响[J].食品科学,2021,42(4):190-196.
XU Yongxia,QU Shiyao,LI Tao,et al.Effects of different proteases on the flavor characteristics of aloididae aloidi muscle hydrolysates[J].Food Science,2021,42(4):190-196.(in Chinese)
[25] 常钰菲.鳕鱼蛋白酶解液中风味物质的构成及脱腥方法研究[D].青岛:中国海洋大学,2015.
CHANG Yufei.Identification of volatile flavor compounds from codfish and study on deodorization methods[D].Qingdao:Ocean University of China,2015.(in Chinese)
[26] FRATINI G,LOIS S,PAZOS M,et al.Volatile profile of Atlantic shellfish species by HS-SPME GC/MS[J].Food Research International,2012,48(2):856-865.
[27] YAO S S,GUO W F,LU Y,et al.Flavor characteristics of lapsang souchong and smoked lapsang souchong,a special Chinese black tea with pine smoking process[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(22):8688-8693.
[28] 夏晓霞,薛艾莲,寇福兵,等.枣加工过程中特征香气物质形成机制研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(23):288-297.
XIA Xiaoxia,XUE Ailian,KOU Fubing,et al.Formation mechanism of characteristic aroma substances during jujube processing:a review[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(23):288-297.(in Chinese)
[29] 徐永霞,张朝敏,赵佳美,等.牙鲆冷藏过程中肌肉挥发性风味成分的变化[J].食品与发酵工业,2016,42(1):219-224.
XU Yongxia,ZHANG Chaomin,ZHAO JIamei,et al.Changes in volatiles of Paralichthys olivaceus muscle during chilled storage[J].Food and Fermentation Industries,2016,42(1):219-224.(in Chinese)
[30] 王福田,杨冰,鲁玉凤,等.不同蒸煮方式青蟹肌肉感官品质分析和比较研究[J].肉类研究,2021,35(6):28-36.
WANG Futian,YANG Bing,LU Yufeng,et al.Analysis and comparative study of sensory qualities of muscle from the mud crab scyllaparamamosain cooked by different methods[J].Meat Research,2021,35(6):28-36.(in Chinese)
[31] WEN Dongling,LIU Yue,YV Qian.Metabolomic approach to measuring quality of chilled chicken meat during storage[J].Poultry Science,2020,99(5):2543-2554.
[32] GAO Binghong,HU Xiaobo,XUE Hui,et al.The changes of umami substances and influencing factors in preserved egg yolk:pH,endogenous protease,and proteinaceous substance[J].Frontiers in Nutrition,2022,26(9):998448.
[33] 施小迪.豆乳及豆乳发酵液不良风味的形成及改善途径研究[D].北京:中国农业大学,2017.
SHI Xiaodi.Study on the formation and improving methods for off-flavor of soymilk and soymilk fermented liquid[D].Beijing:China Agricultural University,2017.(in Chinese)
[34] 葛武鹏,李元瑞,陈瑛,等.牛羊奶酸奶挥发性风味物质固相微萃取GC/MS分析[J].农业机械学报,2008,39(11):64-69,75.
GE Wupeng,LI Yuanrui,CHEN Ying,et al.Analysis of volatile aromatic compounds from cow’s and goat’s milk yoghurt by SPME-GC/MS[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery,2008,39(11):64-69,75.(in Chinese)
[35] GARRIDO-DELGADO R,DOBAO-PRIETO M,ARCE L,et al.Determination of volatile compounds by GC-IMS to assign the quality of virgin olive oil[J].Food Chemistry,2015,187:572-579.